崔英伟， 李长友， 李国勋 ( 青岛农业大学无脊椎动物细胞培养和细胞工程中心)  
摘要： 研究了条件培养基对细胞 B T I — T n 5 B 1 — 4及其克隆株特性的影响。用含 2 0 ％条件培养基以2   x   1 0   c e l l s ／ m l  浓度测定细胞生长曲线， 并与新鲜培养基作比较。结果显示， 含条件培养基的细胞培养中的最大浓度 比对照培养 基的浓度高， 同时细胞群体倍增时间比对照培养基中缩短3—5小时。当用野生型病毒 A c MN P V感染时， 两种培养 基中细胞敏感性均在9 3 ％以上 ， O B产量差异不显著。重组蛋白半乳糖苷酶和碱性磷酸酶表达量测定比较， 结果显 示条件培养基中两种重组蛋白表达量均比对照培养基中高大约 1 0 ％。  
关键词： 条件培养基；昆虫细胞；特性
The   Ef f e c t   o f   Co nd i t i o n a l   Me d i u m  o n   Cha r a c t e r i s t i c s   o f  
BTI—Tn 5 B1—4   Ce l l s   a n d   I t s   Cl o n e s  CUI   Yi n g — we i ， L I   Cha n g — y o u， LI   Gu o — x u n  
( A   C e n t e r   f o r   A d v a n c e d   I n v e r t e b r a t e   C e l l   C u l t u r e   a n d   C e l l   E n g i n e e r i n g ， Q A U， Q i n g d a o   2 6 6 1 0 9 ，C h i n a )  
Ab s t r a c t ：T h e   i n f l u e n c e   o f   c o n d i t i o n a l   me d i u m ( C M)o n   c e l l   c h a r a c t e r i s t i c s   o f   B T I —T n 5 B 1—4   a n d   i t s   c e l l   c l o n e s  
wa s   i n v e s t i g a t e d．A  c o n c e n t r a t i o n   o f   2 0％ CM  wa s   t e s t e d   a t   a   d e n s i t y   o f   2． 0×1 0’ c e l l s ／ml   a n d   c o mp a r e d   t o   r e f e r –  
e n c e   c u l t u r e s( f r e s h   me d i u m，F M) ．T h e   r e s u l t s   s h o w e d   t h a t   t h e   ma x i mu m  c e l l   d e n s i t i e s   i n   C M  c u l t u r e s   we r e   mo r e  
t h a n   i n   F M  a nd   t h e   c e l l   p o p ul a t i o n   do u b l i n g   t i me   i n   CM  wa s   s h o r t e r   t h a n   i n   FM  f o r   3  t o   5   h o u r s ．Whe n   i n f e c t e d  
wi t h   wi l d   Vi r u s   Ac MNP V．t h e   s u s c e p t i bi l i t y   o f   a l l   c e l l s   wa s   a p p r o x i ma t e l y   t h e   s a me   wi t h   a n   i n f e c t i o n   o f   o v e r   93％
o f   t h e   c e l l s   i n   b o t h   c u l t u r e s   o f   C M  o r   F M．T h e   p r o d u c t i o n   o f   o c c l u s i o n   b o d i e s( OB)i n   b o t h   C M  a n d   F M  c u l t u r e s  
wa s   n o t   s i g n i f ic a n t l y   d i f f e r e n t ．P r o d uc t i o n   o f   B—g a l a c t o s i d a s e   a n d   s e c r e t e d   S EAP   a s   t wo   r e c o mb i n a n t   p r o t e i n s   i n  
C M  o r   F M  c u l t u r e s   wa s   c o mp a r e d，b o t h   8一g a l   a n d   S E AP   a c t i v i t i e s   i n   C M  c u l t u r e s   we r e   a b o u t   t e n t h   h i g h e r   t h a n   i n  
F M  c u l t u r e s ．  
Ke y   wo r ds：c o n d i t i o n a l   me d i u m；i n s e c t   c e l l s；c ha r a c t e r i s t i c s  
昆虫细胞培养是近年来迅速发展起来的一个新 领域。人们可以利用杆状病毒在昆虫细胞内的感 染、 增殖， 来大量生产昆虫病毒作为生物杀虫剂。而 昆虫细胞 一杆状病毒表达载体系统的建立， 可通过 昆虫细胞大量表达病毒携带的外源基因。实践证 明， 这一系统高效、 安全、 容量大， 表达的产物具生物 活性， 从而为生产许多具有重要生物学价值的重组条件培养基对昆虫细胞 B T I — T n 5 B 1 — 4及克隆株特性的影响 的质量不同， 影响细胞的生长和病毒复制；③血清 中的蛋白影响从培养的上清液中分离和提取重组蛋 白， 使蛋白的纯化更加困难； ④血清易被支原体污 染。另外， 由于加入部分胎牛血清或牛血清使典型 昆虫培养基成分变得很复杂， 给基因工程表达产物 的后处理带来困难。因此， 昆虫细胞无血清培养基 的发展是细胞培养工程领域的研究热点。  昆虫细胞无血清培养基的研究始于2 O世纪 6 0  年代末和 7 0年代初， 发展无血清培养基， 必须寻找 适当的具有类似于血清功能的因子， 由于血清成分 复杂， 具有多种促细胞生长和增殖因子， 因此要找到 血清的替代物是相当困难的。目前， 通常的添加物 有酵母 自溶物、 蛋白胨、 胰蛋白胨、 蛋黄乳液、 酵母抽 提物水解乳蛋白及微量元素等。  由于无血清培养基中含有从血清或动物脏器中 纯化的蛋白成分， 如胰岛素、 转铁蛋白、 白蛋白和脂 蛋白等， 增加了分离纯化的难度和成本。条件培养 基就是将培养过细胞的培养基去除细胞取其上清，  直接用于培养其他或作为其他细胞培养基的添加成 分。其中含有多种自泌的细胞生长因子， 这些促细 胞生长因子将为新培养基配方提供可靠依据。生长 了3 d 、 2 0 ％的条件培养基对细胞生长有促进作用 U l r i k a   E r i k s s o n等¨ j 。目前世界上应用最多的细胞
系主要 是来 源 于草 地贪 夜 蛾 ( S p o d o p t e r a   f r u g  i p e r d a )的s f 一2 1或其克隆株 S f 一9和粉纹夜蛾 ( T r i c h o p l u s i a   n i )的 B T I—T n 5 B 1—4( H  I G H  F I V E) ， 本文采用 B T I — T n 5 B 1— 4 ( H   I G H   F I V E)及 其克隆株来测定条件培养基对病毒感染率和重组蛋 白表达水平的影响， 为昆虫细胞培养基配方的进一 步开发提供理论依据和有效途径。  
1   精料与方法
1 ． 1   材料
昆虫 细胞 ：B T I—T n 5 B 1—4( H I G H   F I V E) 、  H 5 C L—B、 H 5 C L—F细胞系由美国康奈尔大学G r a —  n a d o s 博士惠赠。  供试病毒：苜蓿银纹夜蛾核 型多角体病 毒 A u t o g r a p h a   c a l i f o r n i c a   m u l t i p l e   n u c l e a r   p o l y h e d r o s i s  v i r u s( A c MN P V)一l A株 ， 含 p一 半乳糖苷酶基因 p  —g a l 的重组病毒 A c MN P V—B— g a l ， 含碱性磷酸酶 基因S E A P的重组病毒 A c MN P V— S E A P 。上病毒 均由美国康奈尔大学 G r a n a d o s 博士惠赠， 病毒的滴 度按照 Wo o d  的方法用 S f 一 9细胞进行空斑测定。  昆虫细胞培养基：有血清培养基是 T N M—F I – I  昆虫细胞培养基， 由 G r a c e细胞培养基( G I B C O公 司) 改进并辅以 1 0 ％胎牛血清 F B S( MD   g e n i c s公 司) ， 无血清培养基为昆虫细胞培养基 S f一9 0 0 m ( G I B C O公司) 。  主要试剂： 二甲基亚砜( D MS O) ( A T C C公司) 、  邻硝基苯基 B—D一半乳糖苷( O N P G) 和对硝基苯 磷酸( P N P P ) ( F L u k a公司) 。  
1 ． 2 方法
1 ． 2． 1   细胞的传代培养
取对数生长期细胞， 在超净工作台中用吸管轻 轻吹打贴壁细胞 ， 制成细胞悬液， 取 1 m l 细胞并加入 4 m l   S f 一 9 0 0 I I I 于培养瓶中， 置于 2 8℃培养箱中静 置培养， 每隔3～ 4   d传代 1次。  
1 ． 2 ． 2 条件培养基制备 取对数生长期细胞， 用血球计数板计数后， 用 S f  一9 0 0 1 1 ／ 稀释 1 ×1 0   c e l l s ／ m l 的细胞液3 ml 于7 5 c m  培养瓶中， 再加人 1 2ml   S f 一 9 0 0 1 1 1 ， 2 8 ℃下培养。3 d  后取上清 6 0 0 0 r p m， 1 0 m i n ， 4 ~ C离心。取上清分装，  4 ℃保存备用。  
1 ． 2 ． 3   细胞 生长曲线的测定
取对数生长期在含2 0 ％ C M的 S f 一 9 0 0 I U 传代 2 2代细胞和 S f 一 9 0 0 I I I中细胞， 用血球计数板计数 后， 用 S f ～9 0 0 I I I 或含 2 0 ％C M   S f 一9 0 0 I i i 稀释到2  ×1 0   c e l l s ／ m l 的浓度， 加到 2 5 c m  培养瓶中， 每瓶 5 m l ， 共做 2 l瓶 ， 2 8 ℃条件下培养。每天取 3瓶细 胞 ， 用血球计数板计数， 计算细胞的平均浓度 ， 绘出 细胞生长曲线， 并按 H a y f l i c k等  的方法计算细胞 群体倍增时间。  
1 ． 2 ． 4 病毒侵染和病毒产量的测定
取对数生长期在含 2 0 ％ C M的 S f 一 9 0 0I U 传代 2 2代细胞和 S f 一 9 0 0 I I I 中的细胞，血球计数板计数 后，按 1 ． 0×1 0   c d l s ／ ~ L 的量接人 2 4孔培养板；  2 8 ％培养2 h ， 吸去培养基，每孔加入 1 ml   A c MN P V  一1 A病毒( 感染复数 M O I ：1 0 ) ， 吸附 1 h后弃去病 毒液。每孔加入 1 m l   S f 一9 0 0 1 1 1 或含 2 0 ％C M   S f 一  9 0 0 I i i ， 2 8 ~ ( 2 培养并观察，1 2 0   h后检查病毒侵染结 果， 病毒多角体( O B)产量的测定参照 Wa n g等 的方法。  
1 ． 2 ． 5 碱性磷酸酶( S E A P ) 和 B一半乳糖苷酶( p  —g a 1 ) 的表达
取对数生长期在含2 0 ％ C M的 S f ～9 0 0 Ⅲ传代 2 2代细胞和S f 一 9 0 0 1 1 1中细胞， 按 1 ． 0×1 0   c e l l s ／ ： ~ L  青岛农业大学学报( 自然科学版)   2 7卷 的量接人2 4孔板中， 2 8   c 【 = 培养 2 h ， 吸去培养基， 将 重组病毒 A c M N P V—S E A P和 A c MN P V—B—g a l 按 感染复数 M O I =1 0的比例感染细胞， 吸附 1 h后弃 去病毒液。每孔加入 1 m l   S f 一 9 0 0 Ⅲ 或含 2 0 ％ C M  S f 一 9 0 0 I I I ， 2 8 ℃条件下培养， 按 D a v i s等  和 Z h e n g  等L 6   的方法， 测定重组蛋白的表达。  
2  结果与分析
2 ． 1  细胞的生长曲线和倍增时间
用含 2 0 ％ C M   S f 一9 0 0 I i I 培养的细胞生长迅 速 ， 状态 良好 。 生长曲线如 图1 。 H5 C L—F在含 图 1 不同细胞株的生长曲线 2 0 ％ C M条件下第 4 d达到最大浓度， 为 1 ． 2 4×  1 0 。 c e l l s ／ m l 。B T I — T n 5 B I一 4第 5 d最大浓度 1 ． 2×  1 0 。 c e l l s ／ m l 。细胞倍增时间均比未加 C M的细胞缩 短3～ 5 h ， 其中B T I —T n 5 B 1 — 4缩短 5 h 。  
2 ． 2 病毒感染和多角体产量
病毒感染和多角体产量测定结果见附表和图 2 。细胞的感染率均在9 3 ％以上， C M对细胞的病毒 感染率和多角体产量有一定促进作用。但各细胞之 间多角体产量无明显差异。  附表 细胞在两种培养基中的 病毒侵染率和病毒产量 注： 表中相同字母表示差异不显著( P< O． 0 1 )  
2 ． 3 半乳糖苷酶( B—g a 1 )和碱性磷酸酶(S E A P)  的表达
重组蛋白表达结果见图3 。H 5 C L—B和 H 5 C L  —F在 2 0 ％ C M和S f 一 9 0 0 m中半乳糖苷酶表达水 图2 感染Ac MNP V一1 A病毒9 6 h的细胞系 1 、 3 、 5   B T I —T n 5 B I一 4、 H 5 C L—B、 H 5 C L—F在S f 一 9 0 0 B I 中的感染； 2 、 4、 6   B T r n S B 1— 4 、 H 5 C L—B、 H 5 C L—F在C M中的感染 6   5   4   3   2   O  
( _ 一 u I n   u  I )   爱  爵 2期  崔英伟 ， 等： 条件培养基对昆虫细胞 B T I —T n S B 1— 4及克隆株特性的影响
3   讨  论
昆虫细胞培养基配方的开发是昆虫细胞培养的 关键之一。目前昆虫细胞培养基有含血清培养基和 无血清培养基。含血清培养基因补加胎牛血清或小 牛血清而增加了生产成本和污染源； 无血清培养基 因含有多种类似血清中的营养蛋白而增加了分离纯 化的难度。因此， 对昆虫细胞培养基配方的开发研 究势在必行。  条件培养基中含有多种 自泌的促细胞生长因
子。生长了3 d 、 2 0 ％的条件培养基对细胞的促进作 用最明显， 前人学者的研究结果对昆虫细胞培养基 配方的开发奠定理论基础。本实验在这基础之上，  采用 B T I —T n S B 1 — 4 ( H   I G H   F I V E)及其克隆株来 测定条件培养基对细胞特性的影响。测定结果显 示： 条件培养基培养下的细胞生长更快， 细胞浓度更 大， 群体倍增时间更短。细胞对野生型病毒的敏感 性提高。重组蛋白半乳糖苷酶和碱性磷酸酶的表达 水平提高大约 1 0 ％。这一研究结果说明条件培养 基中促生长因子还对提高蛋白表达量有促进作用， 时间( d )  为细胞培养基配方的开发提供了又一可靠的理论 依据。  由于细胞之间存在个体差异， 因此不同细胞来 源的条件培养基对细胞的促进作用并不相同， 同一 细胞来源的条件培养基对不同细胞的促进作用也有 差异。因此分离鉴定促生长因子作为细胞培养基的 成分来提高细胞优良特性， 进而还可降低成本